IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) - бул β-галактозидаза субстратынын аналогу, ал жогорку индукциялануучу. IPTG индукциясынын астында индуктор репрессордук белогу менен комплекс түзө алат, ошентип репрессордук белогунун конформациясы өзгөрүп, аны максаттуу ген менен айкалыштырууга мүмкүн болбой калат жана максаттуу ген натыйжалуу экспрессияланат. Ошентип, эксперимент учурунда IPTG концентрациясын кантип аныктоо керек? Канчалык чоң болсо, ошончолук жакшыбы?
Алгач, IPTG индукциясынын принцибин түшүнүп алалы: E. coli лактоза оперону (элементи) үч структуралык генди камтыйт: Z, Y жана A, алар тиешелүүлүгүнө жараша β-галактозидазаны, пермеазаны жана ацетилтрансферазаны коддойт. lacZ лактозаны глюкозага жана галактозага же алло-лактозага гидролиздейт; lacY айлана-чөйрөдөгү лактозанын клетка мембранасы аркылуу өтүп, клеткага киришине мүмкүндүк берет; lacA ацетил тобун ацетил-КоАдан β-галактозидге өткөрөт, бул уулуу эффектти жок кылууну камтыйт. Мындан тышкары, иштөөчү ырааттуулук O, баштапкы ырааттуулук P жана жөнгө салуучу I ген бар. I ген коду - бул оператор ырааттуулугунун O позициясына байлана алган репрессордук белок, ошондуктан оперон (мета) басылып, өчүрүлөт. Ошондой эле, катаболикалык ген активаторунун белок-CAP байланышуу сайты үчүн баштапкы P ырааттуулугунун жогору жагында байланышуу сайты бар. P ырааттуулугу, O ырааттуулугу жана CAP байланышуу сайты чогуу лак оперонунун жөнгө салуучу аймагын түзөт. Ген продуктуларынын координацияланган экспрессиясына жетүү үчүн үч ферменттин коддоочу гендери бир эле жөнгө салуучу аймак тарабынан жөнгө салынат.
Лактоза жок болгондо, лактоза оперону (мета) репрессия абалында болот. Бул учурда, PI промоторунун ырааттуулугунун көзөмөлүндө I ырааттуулугу менен экспрессияланган лактоза репрессору O ырааттуулугуна байланышат, бул РНК полимеразасынын P ырааттуулугуна байланышуусуна жол бербейт жана транскрипциянын башталышын токтотот; лактоза болгондо, лактоза оперону (мета) индукцияланышы мүмкүн. Бул оперон (мета) системасында чыныгы индуктор лактозанын өзү эмес. Лактоза клеткага кирип, β-галактозидаза тарабынан катализденип, аллолактозага айланат. Акыркысы, индуктор молекуласы катары, репрессор белогуна байланышып, белоктун конформациясын өзгөртөт, бул репрессор белогунун O ырааттуулугунан жана транскрипциядан ажырашына алып келет. Изопропилтиогалактозид (IPTG) аллолактоза менен бирдей таасирге ээ. Ал бактериялар тарабынан метаболизденбеген жана абдан туруктуу болгон абдан күчтүү индуктор, ошондуктан ал лабораторияларда кеңири колдонулат.
IPTG оптималдуу концентрациясын кантип аныктоого болот? Мисал катары E. coliди алалы.
Оң рекомбинанттык pGEX (CGRP/msCT) камтыган E. coli BL21 генетикалык жактан инженердик жол менен алынган штаммы 50 мкг·мл-1 ампер камтыган LB суюк чөйрөсүнө эмделип, 37°C температурада түнү бою өстүрүлдү. Жогорудагы культура кеңейтүү культурасы үчүн 1:100 катышында 50 мкг·мл-1 ампер камтыган 10 бөтөлкө 50 мл жаңы LB суюк чөйрөсүнө эмделди жана OD600 мааниси 0,6~0,8 болгондо, акыркы концентрацияга IPTG кошулду. Ал 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1 түзөт. Ошол эле температурада жана ошол эле учурда индукциялангандан кийин, андан 1 мл бактериялык эритме алынган, ал эми бактериялык клеткалар центрифугалоо жолу менен чогултулуп, белок экспрессиясына ар кандай IPTG концентрацияларынын таасирин талдоо үчүн SDS-PAGEге дуушар кылынган, андан кийин белок экспрессиясы эң чоң болгон IPTG концентрациясы тандалып алынган.
Эксперименттерден кийин IPTG концентрациясы мүмкүн болушунча чоң эмес экени аныкталат. Себеби IPTG бактериялар үчүн белгилүү бир уулуу таасирге ээ. Концентрациядан ашып кетүү клетканы да өлтүрөт; жана жалпысынан алганда, клеткада эрүүчү белок канчалык көп болсо, ошончолук жакшы деп үмүттөнөбүз, бирок көп учурларда IPTG концентрациясы өтө жогору болгондо, көп санда кошулмалар пайда болот. Дене, бирок эрүүчү белоктун көлөмү азайган. Ошондуктан, IPTG концентрациясы көбүнчө канчалык чоң болсо, ошончолук жакшы эмес, тескерисинче, концентрациясы төмөн болот.
Генетикалык жактан өзгөртүлгөн штаммдарды индукциялоонун жана өстүрүүнүн максаты - максаттуу белоктун түшүмүн жогорулатуу жана чыгымдарды азайтуу. Максаттуу гендин экспрессиясына штаммдын өзүнүн факторлору жана плазмиданын экспрессиясы гана эмес, ошондой эле индуктордун концентрациясы, индукция температурасы жана индукция убактысы сыяктуу башка тышкы шарттар да таасир этет. Ошондуктан, жалпысынан алганда, белгисиз белок экспрессияланып жана тазаланганга чейин, тиешелүү шарттарды тандоо жана эң жакшы эксперименталдык натыйжаларды алуу үчүн индукция убактысын, температурасын жана IPTG концентрациясын изилдөө жакшы.
Жарыяланган убактысы: 2021-жылдын 31-декабры